IL-10免疫組化IHC

細胞免疫熒光實驗常見問題:1、信號弱或者無信號：細胞或組織樣本保存時間過長；2）抗體濃度不合適，參照抗體說明書的稀釋濃度，再根據(jù)樣本表達量進行摸索；3）一抗孵育時間不合適，建議 4 ℃ 過夜孵育。2、高背景：封閉不充分；抗體濃度過高；抗體孵育時間過長或溫度過高；清洗不充分；樣本變干，染色過程確保樣品始終浸沒于液體環(huán)境中.3、非特異性染色較多：固定液殘留，這里需要縮短固定時間并且在封閉液中加甘氨酸，并且抗原修復也可以幫助解決非特異性染色；二抗殘留，二抗需要用帶有吐溫 20 的 PBS 溶解，只要熒光顯微鏡的強度還可以增大，那么就可以增加吐溫洗脫掉非特異性染色。早期的免疫熒光技術(shù)是將抗體與示蹤物質(zhì)結(jié)合，用于定位組織或細胞內(nèi)的抗原物質(zhì)。IL-10免疫組化IHC

熒光標記二抗的選擇普遍；與使用熒光素結(jié)合一抗的檢測相比，成本較低。間接免疫熒光的缺點：由于需要具有兩種不同物種反應性的兩種抗體，因此物種交叉反應性問題增加；與直接免疫熒光相比，時間更長（操作步驟更多）。間接免疫熒光的優(yōu)點：通過增加能夠與一抗結(jié)合的二抗數(shù)量進行信號放大；與直接免疫熒光相比，通過信號放大提高檢測靈敏度；熒光標記二抗的選擇普遍；與使用熒光素結(jié)合一抗的檢測相比，成本較低。間接免疫熒光的缺點：由于需要具有兩種不同物種反應性的兩種抗體，因此物種交叉反應性問題增加；與直接免疫熒光相比，時間更長（操作步驟更多）。NEUN免疫檢測免疫熒光技術(shù)可以用于研究動物模型和藥物篩選。

免疫熒光實驗的注意事項：對熒光標記的抗體的稀釋，要保證抗體的蛋白有一定的濃度，一般稀釋度不應超過1：20，抗體濃度過低，會導致產(chǎn)生的熒光過弱，影響結(jié)果的觀察。染色的溫度和時間需要根據(jù)各種不同的標本及抗原而變化，染色時間可以從10min到數(shù)小時，一般30min已足夠。染色溫度多采用室溫（25℃左右），高于37℃可加強染色效果，但對不耐熱的抗原（如流行性乙型腦炎病毒）可采用0-2℃的低溫，延長染色時間。低溫染色過夜較37℃30min效果好的多。

細胞免疫熒光步驟是什么呢？步驟：1. 細胞一定要貼在玻片上（較好可以放入24孔板），為后面照像打基礎。細胞密度適中，大約60-75%滿片即可，否則容易脫片。2. 取出細胞后用4%多聚甲醛固定15分鐘，現(xiàn)用現(xiàn)配。（以下各步驟切毋使玻片干燥）3. PBS沖洗；4. 0.1%Triton作用20分鐘；5. PBS沖洗；6. 10%正常血清封閉10分鐘；7. 加入一抗，4度孵育過夜（找個小瓶蓋將小玻片支起來，抗體就不容易溢出），還要記住“砸片”，就是抗體從較高處落到片子上，以分布均勻?？贵w稀釋度1：60，較常用！8. PBS沖洗4次，各5分鐘；9加入熒光二抗，室溫30分鐘?？贵w稀釋度1：400，較常用！10. 90%甘油封片。也很關(guān)鍵阿，多封幾次才有體會。12. 避光保存，或到顯微鏡下觀察。免疫熒光技術(shù)可以用于研究心血管系統(tǒng)的疾病和醫(yī)治。

免疫熒光的制作：樣品準備（貼壁細胞、懸浮細胞以及組織等）：對于貼壁細胞：先將潔凈的蓋玻片在70%乙醇中進行浸泡處理，然后用干凈無菌的鑷子放置到培養(yǎng)皿中，用無菌PBS洗去殘留的乙醇。待細胞接近長成單層后取出蓋玻片，操作小心，防止細胞脫片。對于懸浮細胞：有2種方法，①先在懸浮液中進行固定步驟，然后把細胞滴加在載玻片上，干燥后細胞會緊貼在載玻片上。②先在懸浮液中進行固定和染色步驟，離心洗脫，然后用移液管移至盒式玻片進行后續(xù)染色步驟。對于冷凍切片：切片放置在載玻片上后，可以直接進行固定等后續(xù)操作。對于石蠟切片：免疫熒光中石蠟切片較少，要先進行脫蠟和抗原修復處理。免疫熒光技術(shù)中，以熒光物質(zhì)標記抗體來定位抗原物質(zhì)的方法被稱為熒光抗體技術(shù)。VEGF免疫組化IHC

免疫熒光技術(shù)可以用于研究食品安全和生物安全。IL-10免疫組化IHC

免疫熒光法是將免疫學方法(抗原抗體特異結(jié)合)與熒光標記技術(shù)結(jié)合起來研究特異蛋白抗原在細胞內(nèi)分布的方法。由于熒光素所發(fā)的熒光可在熒光顯微鏡下檢出，從而可對抗原進行細胞定位。用免疫熒光技術(shù)顯示和檢查細胞或組織內(nèi)抗原或半抗原物質(zhì)等方法稱為免疫熒光細胞(或組織)化學技術(shù)。免疫熒光細胞化學是根據(jù)抗原抗體反應的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光素制成熒光標記物，再用這種熒光抗體(或抗原)作為分子探針檢查細胞或組織內(nèi)的相應抗原(或抗體)。在細胞或組織中形成的抗原抗體復合物上含有熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標本，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光(黃綠色或桔紅色)，可以看見熒光所在的細胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位。IL-10免疫組化IHC