廣州雙螺旋科學(xué)儀器供應(yīng)華南地區(qū)雙螺旋生物儀器倍性分析儀

外泌體是一種由細(xì)胞分泌并釋放到細(xì)胞外基質(zhì)的磷脂膜結(jié)構(gòu)囊泡（Extracellular Vesicles，EVs），尺寸在30-150nm之間。外泌體含有蛋白脂質(zhì)核酸等**學(xué)信息、可介導(dǎo)細(xì)胞間的信息交流，大部分分布于血液、眼淚、尿液、唾液、乳汁、腹水等體液以及細(xì)胞培養(yǎng)上清中。外泌體在作為新型的**診斷標(biāo)志物、納米**載體、以及***試劑和**作用靶標(biāo)等方面具有巨大潛力。          

01  外泌體的鑒定

從血液和其他體液中純化EV的較常用技術(shù)是超速離心、尺寸排阻色譜法和PEG沉淀法。這些方法對特定的小顆粒種群有傾向性，并且每種方法都會有不同程度的殘留蛋白和脂蛋白污染水平。提取的外泌體的鑒定方式主要是通過形態(tài)學(xué)（電子顯微鏡技術(shù)）、粒徑大?。{米顆粒**分析）、動態(tài)光散射技術(shù)以及ELISA（檢測外泌體特異性表達(dá)蛋白，如：CD9、CD63、CD81等）等方式來實(shí)現(xiàn)。盡管這些方法可以提供有關(guān)EVs**學(xué)的特征，但它們較終會掩蓋單個顆粒的特征，從而無法正確地分析EVs種群和亞群。

     02 流式細(xì)胞術(shù)對外泌體研究能帶來什么幫助

      相比，流式細(xì)胞術(shù) ( Flow cytometry，F(xiàn)CM)是一種對懸浮液樣品中單顆粒分析的方法，更適合解決EV領(lǐng)域的需求。那么，大家日常使用的流式細(xì)胞儀，是否可以檢測外泌體呢？然而，大部分常規(guī)流式細(xì)胞儀的散射檢測下限是200～500 nm之間，EVs和其他**納米顆粒通常落在常規(guī)流式細(xì)胞儀的背景噪音之內(nèi)，難以滿足這些納米顆粒的靈敏度要求。所以目前大多數(shù)EV檢測中，都是采用較大的微球先去結(jié)合EV，然后再檢測。多一個微球結(jié)合的步驟，又需要多幾步離心，不僅容易丟失EV，而且微球結(jié)合效率也是個很大的變數(shù)。

      流式細(xì)胞術(shù)( Flow cytometry，F(xiàn)CM)具有通量高、用時短、檢測方便的優(yōu)勢，在**顆粒樣本的分析方面較其它技術(shù)具有明顯的優(yōu)勢，是目前外泌體研究比較常用的方法。利用FCM檢測EVs和其他**納米顆粒，由于散射光靈敏度的限制，檢測顆粒通常落在常規(guī)流式細(xì)胞儀的背景噪音之內(nèi)，這限制了它們對分析此類樣品的可用性。近些年，納米流式細(xì)胞儀的興起為細(xì)胞外囊泡的的測定帶來了曙光。與其他鑒定方法相比，納米流式具備很多優(yōu)勢，如：能夠分析的顆粒下限數(shù)量更低、也容易對EVs的細(xì)胞來源進(jìn)行溯源等優(yōu)勢。

圖2.使用納米流式細(xì)胞儀檢測納米微球和EVs[2]

（a）使用納米流式，通過觸發(fā)561nm-SSC分辨出100、200和500 nm聚苯乙烯微球以及噪音信號。

（b）在不同觸發(fā)條件下（488nm-SSC，561nm-SSC綠和488nm-FL通道），分析多個通道（x軸）中噪音和100 nm微球的分離**。

（c）PBS、未染色的DC2.4 EV和經(jīng)過CFSE染色的DC2.4 EV的檢測結(jié)果。

（d）分別觸發(fā)488nm-SSC，561nm-SSC和488nm-FL通道檢測EV的濃度。

03 如何選擇流式細(xì)胞儀進(jìn)行外泌體研究

為了提高傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀的靈敏度，Sysmex-Partec公司研究開發(fā)了一款高性能納米級流式細(xì)胞儀——CyFlow® Space。Space采用高靈敏度的光電倍增管（PMT）檢測器，它具有比較高的量子效率和更低的電子噪聲，從而在更大的波長范圍內(nèi)提高了光檢測靈敏度，可將FSC檢測分辨率擴(kuò)展到50nm下限，顆粒檢測比較大為200μm上限。較高配備5個激光光源和16個光學(xué)參數(shù)（13個熒光通道+2×FSC+SSC）。Space采用靈活的模塊化設(shè)計(jì)，可定制各種不同研究、應(yīng)用用途儀器并可面向不同應(yīng)用定制不同配置。

CyFlow® Space——可選擇的激光光源

CyFlow® Space比較低可檢測50nm顆粒

在檢測小顆粒時，側(cè)向角散射光分辨率優(yōu)于前向角散射光，首要原因在于大部分流式細(xì)胞儀的前向角檢測器使用低靈敏度的二極管，側(cè)向角檢測器和熒光信號檢測器都使用了高靈敏度的光電倍增管（PMT）或雪崩式光電二極管（APD），如果前向角也使用高靈敏度的PMT或APD呢？在檢測常規(guī)顆粒時，原因在于如果檢測顆粒直徑遠(yuǎn)大于入射光波長，即常規(guī)檢測細(xì)胞的情形，散射光符合米氏散射規(guī)律（Mie scattering theory），散射光的信號強(qiáng)度和測量角度密切相關(guān)，前向角的檢測效率優(yōu)于側(cè)向角。但如果在檢測納米顆粒時，直徑遠(yuǎn)小于入射光波長，符合瑞利散射規(guī)律，檢測角度并不是影響散射光效率的因素，側(cè)向角的背景信號會遠(yuǎn)低于前向角，所以SSC在檢測納米顆粒時分辨率會比FSC更有優(yōu)勢。

      CyFlow® Space采用經(jīng)典穩(wěn)定的PMT檢測器，前向角FSC也采用PMT而非低靈敏度的二極管，保證了散射光的分辨率，CyFlow® Space比較低可檢測50nm顆粒，在納米級顆粒分析提供足夠的優(yōu)勢。

使用CyFlow® Space可檢測45nm微球

04  CyFlow® Space檢測紅細(xì)胞外泌體為例

如何采集樣本和分離EV

1、采集血樣后，2000×g離心15分鐘，取上清液。

2、4℃下15,000×g離心30分鐘，去除細(xì)胞碎片，取上清。

3、將上清液用0.2μm濾膜過濾，過濾后110,000×g離心70分鐘（4℃），使囊泡沉淀，棄上清。

4、用經(jīng)過雙次過濾的PBS（1×）重懸沉淀，將重懸液移至一個離心管中，PBS補(bǔ)充足離心管規(guī)定體積，繼續(xù)110,000×g離心70分鐘（4℃），管底可見白色／米白色沉淀，即為外泌體。

5、小心去除上清液，用PBS重懸沉淀，30min內(nèi)上機(jī)檢測。

如何利用流式檢測EV

1、上0.2um濾膜雙次過濾的PBS，確定背景噪音的位置，圈好門。

2、上3種大小不同的聚乙烯微球 (0.1μm, 0.5μm, 2μm)，在測量樣品之前，我們通過校準(zhǔn)不同尺寸（0.1、0.5和2μm）的聚乙烯微球的增益，圈中不同大小微球的位置。

3、上樣本檢測。

4、使用軟件的True Volume Absolute Counting計(jì)數(shù)功能，直接基于濃度的基本定義c = N / V計(jì)算出樣品的較終濃度。

EV檢測結(jié)果

不同樣本紅細(xì)胞外泌體的大小及濃度檢測。uR**s：Uninfectedred blood cells（未**紅細(xì)胞），iR**s：Infectedred blood cells（**紅細(xì)胞），SD：標(biāo)準(zhǔn)差[3]。

Correa R, Coronado L M, Garrido A C, et al. Volatile organiccompounds associated with Plasmodium falciparum, infection in vitro.Parasites & Vectors, 2017, 10(1):215.

05  CyFlow® Space納米流式細(xì)胞儀的其他特點(diǎn)

●無光纖引導(dǎo)，激光空氣傳輸，避免光纖帶來的功率降低和使用成本增加；

●激光器可單獨(dú)開關(guān)，延長激光器壽命；

●真正的插拔式模塊化光路設(shè)計(jì)，便于維護(hù)、保養(yǎng)和升級；

●16個光學(xué)參數(shù)，13個熒光通道+2×FSC+SSC，（均采用光電倍增管技術(shù)，目前主流儀器都采用此類型檢測器，確保數(shù)據(jù)完整記錄）；

●內(nèi)置CCD攝像機(jī)裝置，用于流動室檢測區(qū)液流監(jiān)控。

液路系統(tǒng)

●具備定體積細(xì)胞**計(jì)數(shù)功能（TVAC），無需校正微球，節(jié)約成本；提高精度；

●采用注射泵進(jìn)樣系統(tǒng)，不存在擠壓管路造成管路變形的情況，耗材不易損壞，壽命長達(dá)十年左右；

●250um×350um**流動室，孔徑大不易堵塞，變異系數(shù)CV≤2%；DNA檢測CV≤1％；

●進(jìn)樣速度：0-50ul/s可調(diào)；

●檢測速度：25,000 cells/s；

●可選配自動上樣器，兼容96孔板，384孔板，可在15min完成96孔板分析。

分選系統(tǒng)

●可升級分選系統(tǒng)，操作簡便，兩步操作，選擇待分選細(xì)胞群，**分選按鈕；

●高**安全性，無菌、全封閉設(shè)計(jì)；

●采用不加電、不加壓的**鉆石壓電晶體分選技術(shù)，保證分選細(xì)胞活力；

●低成本，無需等待液流穩(wěn)定，無需計(jì)算液滴延遲。

      納米流式檢測技術(shù)使得研究人員能夠像用傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞那樣對細(xì)胞外囊泡進(jìn)行多參數(shù)定量檢測，具有速度快、統(tǒng)計(jì)精確性好、實(shí)用性強(qiáng)等優(yōu)勢，將為EVs的異質(zhì)性分析、來源鑒定以及基于EVs的診斷標(biāo)志物的探尋和**制劑的開發(fā)等提供**的分析手段。借助CyFlow® Space，可檢測低至50nm顆粒，為納米顆粒的檢測提供了理想的檢測平臺。

參考文獻(xiàn)

[1]. Hong Lian et.al. Flow Cytometric analysis of nanoscale biological particles and organelles. Annual Review of Analytical Chemistry, 2019.

[2]. Aizea Morales-Kastresana, et al. High-fidelity detection and sorting of nanoscale vesicles in viral disease and cancer. Journal of Extracellular Vesicles, 8:1.2019.

[3]. Correa R, Coronado L M, Garrido A C, et al. Volatile organiccompounds associated with Plasmodium falciparum, infection in vitro.Parasites & Vectors, 2017, 10(1):215.