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        1. 浙江N-聚糖水解酶PNGaseF去糖基化酶瑞典Genovis

          來(lái)源: 發(fā)布時(shí)間:2024-06-24

          Genovis的SialEXO Immobilized是一種微離心柱,用于在室溫下孵育30分鐘后完全去除0.5mg天然糖蛋白上的唾液酸。為了研究依那西普的潛在電荷變體,開發(fā)了一種使用SialEXO固定化柱對(duì)糖蛋白進(jìn)行去唾液酸化的一般工作流程。毛細(xì)管電泳通常用于在生物制劑的表征和質(zhì)量控制過(guò)程中確定電荷變體。使用SialEXO Imfixedized對(duì)糖蛋白進(jìn)行去唾液酸化,并使用ProteinSimple的Maurice在成像等電聚焦中進(jìn)行分析。綜合起來(lái),該分析工作流程改進(jìn)了糖蛋白的分離并實(shí)現(xiàn)了電荷異構(gòu)體分析。依那西普,如果不首先去除唾液酸,將很難分析,但使用SialEXO固定化分離峰可以獲得。ImpaRATOR 酶不會(huì)消化未修飾的絲氨酸或蘇氨酸殘基,也不會(huì)在糖蛋白的N-糖基化位點(diǎn)。浙江N-聚糖水解酶PNGaseF去糖基化酶瑞典Genovis

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          GalNAcEXO固定化離心柱含有與瓊脂糖珠共價(jià)偶聯(lián)的GalNAcEXO酶,用于水解糖蛋白上的GalNAc殘基,而不會(huì)用酶污染制劑。Microspin 色譜柱可用于水解 5 或 10 x 0.5 mg 糖蛋白。1. 易于使用的離心柱;2. 提高酶與底物的比例,提高消化效率;3. 終樣品中不含酶。用于水解離心柱中糖蛋白上的Genovis的GalNAc殘基的固定化酶。GalNAcEXO 酶是一種n 外α-N-乙酰半乳糖氨酸酶,可快速有效地水解來(lái)自天然 O-糖蛋白的 z es GalNAc 殘基。 該酶來(lái)源于Akkermansia muciniphila,在大腸桿菌中表達(dá),帶有His標(biāo)簽,分子量為52 kDa。 該酶在 Tn 抗原和 α1-3 連接末端 GalNAcs 上均顯示活性。在這里,我們展示了如何使用GalNAcEXO來(lái)表征復(fù)雜的生物制藥。江蘇固定化小柱形式PNGaseF去糖基化酶糖生物學(xué)研究SialEXO酶來(lái)源于Akkermansia muciniphila,并在大腸桿菌中表達(dá)。

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          Genovis的OglyZOR 是一種內(nèi)切糖苷酶(O-糖苷酶),可特異性水解天然糖蛋白上的he心 1 O-聚糖。OglyZOR 用于去除 O-糖,用于糖分析、確認(rèn) O-糖的存在和降低樣品的異質(zhì)性。Genovis的OglyZOR 是一種內(nèi)切糖苷酶(內(nèi)切-α-N-乙酰半乳糖氨酸酶),可催化來(lái)自天然糖蛋白的he心 1 和有限程度的he心 3 O-聚糖的水解。 OglyZOR酶活性需要去除唾液酸,因此,由唾液酸酶混合物組成的唾液酸凍干,用于去除α2-3,α2-6和α2-8連接的唾液酸,與OglyZOR一起提供。在pH 6.5至7.5和37°C下獲得良好活性。

          為了證明Genovis的PNGase F凍干和PNGase F固定在各種底物上的去糖基化能力,用PNGase F凍干或PNGase F固定化處理了一系列糖蛋白。使用天然反應(yīng)條件在一小時(shí)內(nèi)有效去除曲妥珠單抗和依那西普上的所有N-糖,以及西妥昔單抗上的Fc-糖。當(dāng)加入RapiGest?并在變性條件下進(jìn)行反應(yīng)時(shí),西妥昔單抗的所有N-聚糖(包括Fab-聚糖)在PNGase F固定化10分鐘內(nèi)完全去除,PNGase F固定化15分鐘內(nèi)完全去除。在變性反應(yīng)條件下,PNGase F 在 30 分鐘內(nèi)成功將更復(fù)雜的 F 融合蛋白阿巴西普和阿柏西普去糖基化。使用變性和還原反應(yīng)條件,將常用的糖蛋白標(biāo)準(zhǔn)品RNase B在10或15分鐘內(nèi)完全去糖基化,分別使用PNGase F凍干或PNGase F固定化。在天然和變性條件下生成的去糖基化樣品與LC-MS分析兼容。FucosEXO 在1小時(shí)內(nèi)對(duì)所有三種 TNFR 蛋白去巖藻糖磺酸處理。

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          為了研究 OglyZOR 對(duì)天然糖蛋白的活性,將該酶與依那西普、TNFR 和阿巴西普在 37°C 下有或沒有 SialEXO 孵育 1 小時(shí)。當(dāng)唾液酸被去除時(shí),OglyZOR酶有效地水解了所有三種底物中的O-聚糖。Genovis的OglyZOR 酶可有效水解天然糖蛋白中的he心 1 二糖 (Gal-β1,3-GalNAc)。這使得這些酶適合在LC-MS分析之前制備樣品,以鑒定其他PTM或確認(rèn)氨基酸序列O-糖基化生物制藥的全去糖基化:O-糖基化生物制藥(如依那西普)很難表征。為了能夠通過(guò)質(zhì)譜法測(cè)定完整質(zhì)量數(shù),我們進(jìn)行了酶促總?cè)ヌ腔-聚糖被Genovis的PNGase F裂解,而O-聚糖可以與OglyZOR和SialEXO一起去除。。使用OpeRATOR圖譜O-聚糖位點(diǎn)對(duì)依那西普進(jìn)行LC-MS分析。江蘇固定化小柱形式PNGaseF去糖基化酶糖生物學(xué)研究

          對(duì)游離的N-聚糖的分析表明,SialEXO在溶液中完全脫唾液酸化。浙江N-聚糖水解酶PNGaseF去糖基化酶瑞典Genovis

          我們測(cè)量了FucosEXO從一組dai表不同鍵的不同寡糖底物中釋放的巖藻糖。FucosEXO可有效釋放α1-2、α1-3和α1-4連接的巖藻糖,對(duì)α1-6連接的巖藻糖殘基沒有活Genovis的FucosEXO的底物特異性:巖藻糖以不同的鍵存在于N-和O-聚糖上。α1-2、α1-3 和 α1-4 連接的巖藻糖常見于 O-聚糖中,并作為 N-聚糖的天線巖藻糖基化,而 α1-6 連接的巖藻糖被發(fā)現(xiàn)是 N-聚糖he心的修飾。β1-3,4半乳糖的水解:Genovis的GalactEXO 是一種β-半乳糖苷酶混合物,可水解 N-和 O-糖基化蛋白中的 β1-3,4-連接末端半乳糖。浙江N-聚糖水解酶PNGaseF去糖基化酶瑞典Genovis

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