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        1. 山西PNGaseF去糖基化酶糖生物學(xué)研究

          來(lái)源: 發(fā)布時(shí)間:2024-07-15

          G0F 抗體在 30 分鐘內(nèi):半乳糖的存在會(huì)影響zhiliao性抗體引發(fā)的效應(yīng)功能,為了研究抗體的作用方式,可能需要徹底去除半乳糖殘留物。Genovis的GalactEXO Immobilized 的 β1-4 半乳糖苷酶活性在曲妥珠單抗上使用 30 分鐘孵育證明。genovis的GalactEXO Immobilized 由強(qiáng)大的 GalactEXO 酶組成,該酶固定在瓊脂糖珠上,并以易于使用的微離心柱形式格式化。GalactEXO是β-半乳糖苷酶的混合物,可有效去除N-和O-糖基化蛋白上的半乳糖殘基。使用FabRICATOR?將抗體消化成亞基,并使用LC-MS進(jìn)行分析。使用 GalactEXO 凍干和 GalactEXO 固定化都可以看到向 G0F 糖型的轉(zhuǎn)變,但后者在z終制劑中沒(méi)有留下酶。沒(méi)有任何半乳糖基化結(jié)構(gòu)表明半乳糖殘基完全水解,因此LC-MS數(shù)據(jù)中任何剩余的次要峰都可以注釋為亞基的糖化。沒(méi)有任何半乳糖基化結(jié)構(gòu)表明半乳糖殘基完全水解,因此LC-MS數(shù)據(jù)中任何剩余的次要峰都可以注釋為亞基的糖化。GalNAcEXO 是一種 α-N-乙酰半乳糖胺苷酶,可有效水解糖蛋白上的末端 GalNAc 殘基。山西PNGaseF去糖基化酶糖生物學(xué)研究

          山西PNGaseF去糖基化酶糖生物學(xué)研究,PNGaseF去糖基化酶

          GalNAcEXO固定化離心柱含有與瓊脂糖珠共價(jià)偶聯(lián)的GalNAcEXO酶,用于水解糖蛋白上的GalNAc殘基,而不會(huì)用酶污染制劑。Microspin 色譜柱可用于水解 5 或 10 x 0.5 mg 糖蛋白。1. 易于使用的離心柱;2. 提高酶與底物的比例,提高消化效率;3. 終樣品中不含酶。用于水解離心柱中糖蛋白上的Genovis的GalNAc殘基的固定化酶。GalNAcEXO 酶是一種n 外α-N-乙酰半乳糖氨酸酶,可快速有效地水解來(lái)自天然 O-糖蛋白的 z es GalNAc 殘基。 該酶來(lái)源于Akkermansia muciniphila,在大腸桿菌中表達(dá),帶有His標(biāo)簽,分子量為52 kDa。 該酶在 Tn 抗原和 α1-3 連接末端 GalNAcs 上均顯示活性。在這里,我們展示了如何使用GalNAcEXO來(lái)表征復(fù)雜的生物制藥。廣東凍干粉形式PNGaseF去糖基化酶蛋白質(zhì)組學(xué)研究O-連接聚糖通常存在于蛋白質(zhì)的暴露位置,因?yàn)樗鼈冊(cè)诘鞍踪|(zhì)折疊發(fā)生后附著。

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          與PNGase F類(lèi)似,Genvois的OmniGLYZOR用于攜帶N-和簡(jiǎn)單O-糖的糖蛋白的去糖基化。 OmniGLYZOR 試劑盒包括:OmniGlyZOR 微離心柱;PNGase F 凍干;RapiGest?* SF表面活性劑。除非底物蛋白變性,否則某些 N-糖基化位點(diǎn)很難或無(wú)法被 PNGase F 接近。在OmniGLYZOR Microspin柱上孵育后剩余的N-糖可以在變性條件下使用試劑盒中包含的PNGase F凍干和RapiGest? SF表面活性劑通過(guò)額外的去糖基化步驟去除。使用Genovis的OpeRAT對(duì)EPO進(jìn)行O-糖位點(diǎn)特異性消化:對(duì)于jin攜帶一個(gè)或幾個(gè) O-糖基化位點(diǎn)的簡(jiǎn)單底物蛋白,OpeRATOR 也可用于繪制中間水平的 O-糖基化位點(diǎn)。

          為了研究 OglyZOR 對(duì)天然糖蛋白的活性,將該酶與依那西普、TNFR 和阿巴西普在 37°C 下有或沒(méi)有 SialEXO 孵育 1 小時(shí)。當(dāng)唾液酸被去除時(shí),OglyZOR酶有效地水解了所有三種底物中的O-聚糖。Genovis的OglyZOR 酶可有效水解天然糖蛋白中的he心 1 二糖 (Gal-β1,3-GalNAc)。這使得這些酶適合在LC-MS分析之前制備樣品,以鑒定其他PTM或確認(rèn)氨基酸序列O-糖基化生物制藥的全去糖基化:O-糖基化生物制藥(如依那西普)很難表征。為了能夠通過(guò)質(zhì)譜法測(cè)定完整質(zhì)量數(shù),我們進(jìn)行了酶促總?cè)ヌ腔-聚糖被Genovis的PNGase F裂解,而O-聚糖可以與OglyZOR和SialEXO一起去除。。為了測(cè)試選擇性,將一系列 O-糖基化、N-糖基化和非糖基化蛋白與 GlycOCATCH 一起孵育:洗脫O-糖基化蛋白。

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          水解O-聚糖的酶不會(huì)從變性中獲益,這就是為什么OmniGLYZOR色譜柱只能在天然條件下使用的原因。 OmniGLYZOR 試劑盒 Microspin 以含有足夠材料的試劑盒形式提供,可使5 × 50-100 μg 或 10 × 50-100 μg 糖蛋白去糖酸化。N-和O-連接聚糖的快速高效;與LC-MS兼容;完全去除聚糖,改進(jìn)基礎(chǔ)蛋白的分析;固定形式可提高酶與底物的比率,從而實(shí)現(xiàn)快速去糖基化。 IgdE酶(FabALACTICA?)和PNGaseF酶分別購(gòu)自Genovis(馬薩諸塞州,美國(guó))。用于水解糖蛋白上N-聚糖的凍干酶。Genovis的PNGase F 凍干劑以?xún)龈煞鄣男问教峁?,裝在 1000 或 5 x 1000 單位小瓶中,分別用于消化 1 mg 或 5 x 1 mg 糖蛋白。SialEXO用于OpeRATOR或OglyZOR消化前預(yù)處理O-糖基化蛋白。河南瑞典GenovisPNGaseF去糖基化酶

          兩種酶都含有 His 標(biāo)簽,酶的分子量為 43 kDa 和 66 kDa。山西PNGaseF去糖基化酶糖生物學(xué)研究

          為了證明Genovis的PNGase F凍干和PNGase F固定在各種底物上的去糖基化能力,用PNGase F凍干或PNGase F固定化處理了一系列糖蛋白。使用天然反應(yīng)條件在一小時(shí)內(nèi)有效去除曲妥珠單抗和依那西普上的所有N-糖,以及西妥昔單抗上的Fc-糖。當(dāng)加入RapiGest?并在變性條件下進(jìn)行反應(yīng)時(shí),西妥昔單抗的所有N-聚糖(包括Fab-聚糖)在PNGase F固定化10分鐘內(nèi)完全去除,PNGase F固定化15分鐘內(nèi)完全去除。在變性反應(yīng)條件下,PNGase F 在 30 分鐘內(nèi)成功將更復(fù)雜的 F 融合蛋白阿巴西普和阿柏西普去糖基化。使用變性和還原反應(yīng)條件,將常用的糖蛋白標(biāo)準(zhǔn)品RNase B在10或15分鐘內(nèi)完全去糖基化,分別使用PNGase F凍干或PNGase F固定化。在天然和變性條件下生成的去糖基化樣品與LC-MS分析兼容。山西PNGaseF去糖基化酶糖生物學(xué)研究

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