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如何科學(xué)正確地使用凍存管-杭州邁恩
凍存管的使用是一門學(xué)問，并不是打開液氮罐、放入凍存管、關(guān)上液氮罐這樣簡單的三部曲可以完成的?？茖W(xué)正確地使用凍存管，可以避免樣本的損失，并保護(hù)試驗(yàn)人員的安全。
冷凍步驟
1.用預(yù)熱的PBS溶液洗滌細(xì)胞，吸取溶液，含有胰蛋白酶和EDTA的溶液覆蓋細(xì)胞(薄薄的液層足夠，胰蛋白酶和EDTA的濃度需要根據(jù)細(xì)胞系確定)。
2.37℃孵育細(xì)胞3-5分鐘。
3.細(xì)胞從底部脫離之后，終止孵育，加入含有血清的培養(yǎng)基，用移液器輕輕地懸浮細(xì)胞。
4.離心細(xì)胞懸液(500 x g, 5分鐘)，用含有血清的培養(yǎng)基重新懸浮。
5.細(xì)胞計(jì)數(shù)。
6.離心細(xì)胞懸液(500 x g, 5分鐘)，去除上清液，用適量體積的含有血清的培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞。
7.以1:1體積比混合細(xì)胞和凍存液(60%培養(yǎng)基，20%胎牛血清，**MSO)，然后轉(zhuǎn)移到Cryo.sTM凍存管中。凍存的細(xì)胞密度為 1-5×106 個(gè)/毫升。
8.含有細(xì)胞的Cryo.sTM凍存管建議以?1 K / min 的速率降溫，可以將凍存管置于?70℃含有異丙醇的容器中。如果Cryo.sTM凍存管存儲(chǔ)其他樣品，可以直接放置在?20℃，?70℃或者液氮的氣相。為了確保樣品冷凍均勻，4 mL和5 mL的Cryo.sTM凍存管需要先置于在?20℃冰箱過夜，然后再轉(zhuǎn)移到?70℃或者液氮的氣相。
9.然后轉(zhuǎn)移Cryo.sTM凍存管到液氮罐。為了避免污染(如支原體)和安全考慮，請將Cryo.sTM凍存管置于液氮的氣相，切勿置于液相。
解凍步驟
1.從液氮罐取出凍存的細(xì)胞后立即置于37℃水浴搖晃Cryo.sTM凍存管1-2分鐘。解凍過程需要越快越好。
2.轉(zhuǎn)移解凍的細(xì)胞于15 mL離心管，立即用大量的含有血清的細(xì)胞培養(yǎng)基混勻。
3.500 x g離心細(xì)胞5 分鐘，去除上清液，用適量的含有血清的細(xì)胞培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞，然后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)瓶。
4.按照建議的細(xì)胞濃度接種。
5.接下來的12小時(shí)細(xì)胞進(jìn)入靜默期。
6.間隔24小時(shí)和48小時(shí)更換培養(yǎng)基。
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